July 30, 2018

X-ray Crystallography: Menjelajahi Perbatasan Biologi Struktural

KUTULIS INFOPendekatan mendasar untuk kristalografi berbasis struktur belum benar-benar berubah sejak 1913, ketika ayah dan anak duo, WH dan WL Bragg, memecahkan struktur pertama dari materi apa pun pada resolusi atom. 

"Percobaan dasar adalah untuk menembakkan sinar X-ray pada lapisan kristal apa pun yang Anda pelajari, dan Anda dapat menghitung struktur molekul dari pola difraksi," jelas Profesor Brian Sutton, Profesor Biofisika Molekuler di King's College London.

Empat puluh tahun kemudian, gambar dari hasil difraksi sinar-X Rosalind Franklinmemungkinkan penemuan salah satu struktur molekul paling terkenal yang pernah ditentukan, heliks ganda DNA Watson dan Crick .

Baca juga : Apa yang dimaksud dengan tingkat Alkaline phosphatase abnormal?

"Kami selalu pergi dengan mantra itu jika Anda tahu strukturnya, Anda dapat memahami cara kerjanya - itu pasti benar untuk DNA," kata Sutton.

The bidang kristalografi sinar-X dipenuhi dengan hadiah Nobel dan terus merevolusi pemahaman kita tentang struktur materi, dengan dampak yang luas mencakup seluruh fisika, kimia, biologi dan kedokteran.

X-ray Crystallography: Menjelajahi Perbatasan Biologi Struktural

Sinar X lebih intens


Karena teknik ini masih sangat bergantung pada susunan reguler material dalam 3-D, tantangan terbesar masih terletak pada mendapatkan kristal dengan ukuran dan kualitas yang memadai. 

“Karena molekul biologis memiliki banyak fleksibilitas dan heterogenitas yang inheren, sangat sulit untuk mendapatkan kristal berkualitas baik,” jelas Dr Andrew Leslie, Pemimpin Kelompok di Laboratorium MRC untuk Biologi Molekuler di Cambridge.

Tetapi sumber-sumber X-ray baru yang kuat, banyak pesanan yang lebih besar daripada yang dapat dicapai di laboratorium, membantu melewati tantangan ini. Saat ini, hampir semua struktur diselesaikan dengan menggunakan data yang dikumpulkan pada akselerator partikel yang disebut synchrotrons, seperti di Diamond Light Source Inggris di Harwell, atau European Synchrotron Radiation Facility di Grenoble, Prancis.

"Mereka mengurangi waktu pengumpulan data Anda jika Anda punya kristal besar, tetapi Anda juga bisa mendapatkan data dari kristal yang jauh lebih kecil dan itu benar-benar telah membuat perbedaan yang luar biasa," kata Sutton.

Peningkatan dramatis dalam kecepatan juga membantu para peneliti untuk mengatasi heterogenitas dalam kualitas kristal.

“Anda mungkin ingin mengumpulkan data dari 30 kristal untuk menemukan yang terbaik sehingga dapat melakukannya dalam skala waktu realistis yang Anda perlukan untuk dapat mengumpulkan data dengan cepat,” jelas Leslie.

Difraksi untuk penghancuran


Baru-baru ini, sinar-X laser-elektron bebas (XFEL) yang dapat menghasilkan pulsa yang sangat kuat dalam rezim X-ray, memberikan peluang baru untuk menyelesaikan kristal sub-mikroskopis.

"Ide dari sumber-sumber baru ini adalah untuk memukul kristal dengan pulsa X-ray femtosecond yang begitu kuat sehingga meniup kristal terpisah," jelas Leslie.

Namun, pendekatan destruktif ini memungkinkan untuk menghasilkan hanya satu gambar untuk setiap kristal. Tetapi untuk menyelesaikan analisis struktural, ratusan, atau sangat sering puluhan ribu gambar difraksi diperlukan.

"Jadi orang-orang mengumpulkan ratusan ribu gambar dengan mengalirkan aliran kristal dalam sebuah jet melalui sinar X-ray dan mengumpulkan hanya satu gambar dari masing-masing," kata Leslie.

Pada 2017, para ilmuwan pertama menunjukkan potensi besar menggunakan pendekatan ini dengan memecahkanstruktur enterovirus sapi (BEV2).

Membuat film molekuler berskala nano


Sumber-sumber energi tinggi ini, bersama dengan menaikkan suhu yang biasanya digunakan untuk difraksi sinar-X, membukaera baru dari studi struktural yang diselesaikan secara waktu.

Secara tradisional, ahli biologi struktural memusatkan perhatian mereka pada pengumpulan data dari kristal tunggal dalam semua rotasi yang mungkin, menggunakan suhu cryogenic untuk membatasi kerusakan dari sinar X-ray.Namun, pendekatan ini hanya memberikan gambaran statis.

"Di masa lalu, protein Anda terjebak dalam kristal dalam satu orientasi tetapi dalam kenyataannya, itu mungkin berdenyut," jelas Sutton.

Melakukan analisis serial pada suhu kamardan / atau menggunakan XFEL, membuka pintu untuk mengamati gerakan molekuler halus yang mungkin penting untuk berfungsi. Ini juga menawarkan prospek menarik untuk memvisualisasikan semua tahapan proses interaktif seperti enzim selama siklus katalitik, atau antibodi yang mengikat antigen.

"Jika Anda bisa melakukan itu sementara kristal-kristal itu mengalir melalui pancaran Anda bisa menempatkan semua snapshot dari masing-masing tahapan proses bersama dan membuat film," Sutton menjelaskan.

Para ilmuwan sedang melakukan penelitian menarik ini sekarang.

"Kami benar-benar tidak bisa melakukan ini sebelumnya, tetapi sekarang kita bisa - Anda dapat melihat proses atom yang bergerak hanya fraksi angstrom atau nanometer," kata Sutton.

Pembuatan model dengan bantuan komputer


Kemajuan dalam pengumpulan data, analisis, dan penyimpanan juga memungkinkan peneliti untuk mempelajari struktur biologis yang lebih kompleks, menggunakan perangkat lunak canggih dan program grafis yang secara otomatis akan membangun model awal mereka.

"Orang bahkan bisa mendapatkan struktur awal saat masih di sinkrotron mengumpulkan data," kata Leslie.

Namun, upaya pertama tidak pernah sempurna dan akan selalu membutuhkan perbaikan lebih lanjut diikuti dengan validasi hati-hati.

"Ini mungkin untuk penyempurnaan ini untuk mendistorsi, sehingga kita kemudian perlu memeriksa bahwa model terakhir memiliki stereokimia yang diharapkan," jelas Leslie.

Peneliti kemudian akan menyimpan koordinat akhir ke dalam Bank Data Protein (PDB), gudang pusat dengan informasi tentang bentuk 3-D dari protein, makromolekul dan rakitan kompleks, yang sekarang berisi lebih dari 140.000 struktur .The Cambridge Structural Database , yang berisi lebih dari 900.000 entri, menyediakan sumber daya yang sama untuk molekul kecil.

“Mereka menjalankan alat validasi mereka sendiri terhadap model dan menyoroti apa pun yang mereka anggap tidak biasa atau mungkin salah dan meminta Anda untuk kembali dan melihat lebih dekat,” jelas Leslie.

Saat ini, dalam kasus yang paling sederhana, seluruh proses pembuatan kristal untuk mendapatkan struktur akhir dapat dilakukan dalam beberapa minggu.

Desain obat berdasarkan struktur


Tujuan blue-sky dari kristalografi X-ray adalah untuk mendapatkan informasi tentang fungsi molekul dari strukturnya.Tetapi penerapan praktisnya yang paling jelas adalah dalam desain obat , dengan banyak keberhasilan penting yang menunjukkan kekuatannya, termasuk obat-obatan untuk HIV dan kanker . 

G-protein coupled receptors (GPCRs) adalah keluarga protein pensinyalan transmembran yang sangat penting dalam farmakologi karena keterlibatan substansial mereka dalam berbagai penyakit, dengan perkiraan sepertiga dari semua obat yang menargetkan mereka .Karena banyak yang memiliki efek off-target, para peneliti telah mencoba untuk menyimpulkan struktur banyak GPCR untuk membantu desain obat yang lebih spesifik dengan lebih sedikit efek samping.Namun, selama bertahun-tahun mereka terbukti sangat sulit untuk retak karena mereka tidak stabil dan sangat sulit untuk dikristalkan. 

"Orang-orang telah bekerja selama 30 tahun atau lebih dan tidak mendapatkan apa-apa, tetapi selama 10 tahun terakhir ini telah terjadi ledakan dalam jumlah GPCR yang telah ditentukan secara struktural ," kata Leslie.

Serta mengajar ahli biologi lebih banyak tentang bagaimana GPCR bekerja, kebingungan informasi struktural ini juga memicu penemuan obat.

"Ada sejumlah senyawa sekarang dalam berbagai tahap uji klinis yang didasarkan pada informasi struktural ini dari kristalografi," kata Leslie.

Mempelajari alam dalam detail terkecilnya


Lebih dari satu abad sejak awal, kristalografi sinar-X terus membuat dampak besar di banyak bidang biologi dan kedokteran - tetapi pendekatan dasarnya tetap sama.

"Itu hal yang menakjubkan, bahkan dengan semua teknologi baru, pada dasarnya Anda hanya menembakkan sinar-X pada susunan molekul teratur dan bekerja keluar dari pola difraksi di mana atom berada," kata Sutton.

Tantangan terbesar tetap ada di sekitar menghasilkan kristal, tetapi kemajuan teknologi memungkinkan peneliti untuk menambah struktur strukturnya yang berkembang dan menonton gerakan molekuler kecil yang mungkin penting untuk berfungsi.

Tidaklah sulit untuk menghargai mengapa mereka yang bekerja di lapangan sangat bersemangat dengan pekerjaan mereka.

"Saya suka melihat struktur untuk pertama kalinya, itu adalah perasaan yang luar biasa," kata Sutton. 
Advertisement

No comments:

Post a Comment